Molekulargenetische Untersuchungen zu Polymorphismen von Glutathion-S-Transferasen aus den Klassen M

Kurzbeschreibung

Glutathion-S-Transferasen (GSTs) katalysieren die Bindung von Fremdstoffen mit Glutathion. Multiple Unterformen werden gewebsspezifisch im Zytosol oder gebunden an Membranen in fast allen Zellen des menschlichen Organismus exprimiert. Wegen ihres breiten Spektrums enzymatischer Aktivität gegenüber elektrophilen Substanzen gelten GSTs als ein wichtiger Bestandteil des zellulären Schutzsystems gegen Karzinogene. Derzeit sind beim Menschen vier Klassen cytosolischer GSTs bekannt (GSTA, GSTM, GSTT und GSTP), deren multiple Unterformen durch zum Teil hochgradig homologe Gene codiert werden, wobei für einige GSTs die Existenz von Allelvarianten beschrieben wurde. Aus epidemiologischer Sicht als potentielle Suszeptibilitätsfaktoren für Krebs besonders interessant sind die Null-Polymorphismen von GSTM1 und GSTT1. Diese erblichen Deletionen betreffen jeweils das komplette Gen und führen bei Homozygotie zu einem vollständigen Fehlen der entsprechenden GST, was als Suszeptibilitätsfaktor für Krebs von großer Bedeutung zu sein scheint.
Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden die erblichen Polymorphismen von GSTM1 und -T1 auf genetischer Ebene nachzuweisen und in klinischen Studien anzuwenden, um den Einfluß der GSTM1- und -T1-Enzymdefizienz auf die Erkrankung an Bronchial- und Blasenkarzinom zu untersuchen.

Der Vergleich der Aminosäure- und DNA-Sequenzen zeigte ein hohes Maß an Homologie zwischen den GSTM-Genen (80% - 100% Übereinstimmung in der cDNA-Sequenz). Für eine genspezifische Analyse ausreichende Unterschiede konnten in den Exons 5 und 6 identifiziert werden (65% - 83 % Übereinstimmung in der cDNA-Sequenz). Auf dieser Basis wurden verschiedene PCR-Methoden entwickelt, um die Deletion von GSTM1 zu detektieren und die GSTM1A- und B-Allele zu differenzieren. Die Gen- und Allelspezifität der PCR-Amplifikate konnte mittels DNA-Sequenzierung bestätigt werden. In der Folge zahlreicher Optimierungen wurde mit dem acquired restriction site- (ACRS-) Assay eine Methode etabliert, mit der einfach, schnell und zuverlässig die Defizienzen von GSTM1 und T1, sowie beide aktive GSTM1-Allele A und B in einer einzigen durch einen Internen Standard kontrollierten PCR-Reaktion mit anschließender Restriktionsenzymspaltung nachgewiesen werden können. Somit war durch Genotypisierung die Klassifizierung von vier GSTM1 (0/0, A/A oder A/0, B/B oder B/0 und A/B) und zwei GSTT1 (0/0 und A/A oder A/0) Genotypen möglich. Umfangreiche Versuchsserien auch die heterozygoten Träger von nur einem aktiven GSTM1-Allel (Genotypen A/0 oder B/0) durch quantitative Auswertung der PCR-Produkte zu unterscheiden, führten nicht zu einer zuverlässigen Differenzierung.

Es erfolgten umfangreiche Vergleiche zwischen den molekulargenetischen Ergebnissen und funktionellen Messungen mit dem GSTM1-Substrat trans-Stilbenoxid und GSTM1-Proteingehaltsbestimmungen. Die entwickelten Genotypisierungsverfahren erlaubten in 99,6 % der Fälle eine korrekte Vorhersage des Phänotyps. Keine Unterschiede fanden sich in der Enzymaktivität zwischen den beiden Varianten GSTM1a-1a und GSTM1b-1b, bzw. dem Heterodimer GSTM1a-1b.

Im Rahmen von zwei Fall-Kontroll-Studien wurden 174 Bronchialkarzinompatienten, 296 Blasenkarzinompatienten und 372 Referenzpatienten hinsichtlich ihrer Deletionsmutationen von GSTM1 und -T1 typisiert. GSTM1. Unter den Bronchialkarzinompatienten trugen 52,1% und unter den Blasenkarzinompatienten 59,1% den GSTM10/0-Genotyp im Vergleich zu 51,6% in der Kontrollgruppe. Während sich die Häufigkeit der GSTM1-Defizienz bei Lungenkarzinom- und Kontrollpatienten kaum unterschied, war GSTM10/0 in Blasenkarzinompatienten signifikant überrepräsentiert, die Odds Ratio betrug 1,40 (95% CI = 1,02 - 1,92; p = 0,017). Damit könnten 16,9% der Blasenkrebserkrankungen mit dem Fehlen von GSTM1 erklärt werden. Die Differenzierung der Allelvarianten identifizierte das GSTM1A-Allel als möglichen Schutzfaktor vor Blasenkrebs, der Anteil dieses Allels war in der Blasenkarzinomgruppe deutlich vermindert (25,7% versus 35,8%), das B-Allel dagegen etwa gleich häufig wie in der Referenzgruppe (17,6% versus 15,1%). GSTT1. Die Defizienz von GSTT1 konnte mit einer Häufigkeit von 17,8% (Bronchialkarzinom), 18,6% (Blasenkarzinom) und 20,6% (Kontrollen) detektiert werden und zeigte damit keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kollektiven.

Die Charakterisierung von GSTs mit molekulargenetischen Methoden ist einfach und auch an großen Probandenzahlen schnell durchführbar und ist in ihrer Zuverlässigkeit den bislang angewendeten Phänotypisierungen deutlich überlegen. Die Genotypisierung ist somit die Methode der Wahl in epidemiologischen Studien, zumal der Genotyp ein zeitlebens konstanter Parameter ist, der sich im Gegensatz zu Enzymaktivitäten nicht durch erkrankungsassoziierte metabolische und hormonale Einflüsse verändert. Da GSTs ein großes teilweise überlappendes Spektrum potentiell toxischer Substanzen metabolisieren können, sollten zur Erforschung epidemiologischer Interaktionen (gegenseitige Risikoabschwächung oder -verstärkung) auch die erst kürzlich identifizierten Polymorphismen von GSTM3 und GSTP1 in epidemiologische Studien eingeschlossen, bzw. auch weitere GSTs auf eine mögliche polymorphe Expression hin untersucht werden.